网站地图欢迎访问成都亲子鉴定中心。
您当前的位置:主页 > 技术文档 >

三种血液样本的DNA提取与定量方法

更新时间:2020-06-11 来源:东南大学 编辑:蒋浩君

  DNA鉴定中,我们首先要提取被检测样本中的DNA,其中血液样本的使用频率相对较高,而血液样本根据形态的不同又分为全血样本、血斑样本、血浆样本三种,下面我们就讲讲这三种血液样本的DNA提取方法,以及后续的DNA定量处理。(补充说明:DNA量过高,会出现非特异性扩增,过低可能导致等位基 因的“丢失”,所以在进行扩增前,一定要对DNA精确定量。)

  1、全血样本DNA提取

  根据Qiagen Tissue&Blood DNA Kit的操作说明进行提取,具体操作过程如下:

  1.用移液管吸20μL蛋白酶放在1.5ml离心管中。

  2.向上述1.5mL的离心管中加入200μL全血样本。

  3.向上述的1.5mL的离心管中加入200μL Bufer AL至样品,震荡15秒;56°C水浴加热10分钟。

  4.轻微离心一下离心管,使盖子上及管壁上的样品滴下来至管子底部。

  5.加入200μL乙醇(96-100%),震荡混匀15秒,轻微离心使盖子上的样品滴下来。

  6.小心地把混合物加入吸附柱管中,小心不要加到盖子上,合上盖子8000rpm离心1分钟,把柱子放到新管子中,弃滤液。

  7.小心打开离心管的盖子,加入50μL Bufer AW1,不能加到边缘上,盖上盖子8000rpm离心1分钟,把柱子放到新管子中,弃滤液(如果有必要重复此步骤)。

  8.小心打开离心管的盖子,加入50μL Bufer AW2,不能加到边缘上,盖上盖子14000rpm离心,弃废液。

  9.空管14000rpm离心3分钟,把柱子放到新管子中,弃滤液10、全速空转1分钟,以去除可能存在的AW2.

  10.把吸附柱放在干净的离心管中,打开吸附柱盖子加入5μL BUfer AE,室温中静置10分钟,8000rpm离心1分钟。

  11.收集离心后的液体,并进行DNA定量。

全血液样本

  2、血斑样本DNA提取

  根据Qiagen Tissue&Blood DNA Kit的操作说明进行提取,具体操作过程如下:

  1.打开超净台的紫外灯,灭菌30min;

  2.向打孔器喷75%的医用酒精,并使用酒精灯对打孔器进行30s的灼烧;

  3.使用打孔器在血斑处打下3mm直径的圆斑3个,并放入至1.5mL的离心管中;

  4.向上述1.5mL的离心管中加入180μL的ATL,充分震荡混匀,并短暂进行离心;

  5.将上述1.5mL的离心管放置温浴仪中,80°C反应10分钟;

  6.短暂离心后,加入20μL的蛋白酶K溶液,充分震荡混匀,并短暂进行离心;

  7.将上述1.5mL的离心管放置在温浴仪中,56°C反应1小时;

  8.短暂离心后,加入200μL的AL,充分震荡混匀,并短暂进行离心;

  9.将上述1.5mL的离心管放置在温浴仪中,70°C反应10分钟;

  10.短暂离心后,向上述1.5mL的离心管中加入200μL的无水乙醇,充分震荡混匀,并短暂进行离心;

  11.将上述1.5mL离心管中的液体转入Qiagen的DNA收集管中,8000rpm离心1分钟后,丢弃液体;

  12.向DNA收集管中加入50μL的AW1,8000ipm离心1分钟后,丢弃液体;

  13.向DNA收集管中加入50μL的AW2,8000rpm离心1分钟后,丢弃液体1;

  14.对DNA收集管进行空转12000rpm,3分钟;

  15.小心对DNA收集管四周的残留液体用移液枪吸取丢弃,并将DNA采集管放置在新的干净的1.5mL的离心管中,并在室温中进行晾干,晾干时间5分钟;

  16.向DNA收集管悬空正中加入5μL的AE bufer,并室温放置5分钟,使DNA收集管中的DNA充分和溶解液进行反应;

  17.对DNA收集管进行12000rpm,2分钟离心,收集DNA溶液。

血斑样本

  3、血浆样本DNA提取(MagPure Circulating DNA Maxi Kit)

  [1]血浆分离

  A.室温静置半个小时,在4°C条件下以1600g离心10分钟,离心后将上清(血浆)分装到多个2.0ml的离心管中,在吸取的过程中注意不要吸取到中间层的白细胞。

  B.在4°C条件下对分装的2.0ml的离心管以16000g(正常14000g)离心10分钟,去除残余细胞,将上清转入新的1.5ml或2.0ml的离心管中,即为所需的血浆。打上标签,-80°C保存。

  [2]根据MagPure Circulating DNA Maxi Kit的操作说明进行血浆DNA提取,具体操作过程如下:

  1.在2.0ml离心管中,加入30μL Proteinase K和5μL MagPure Particles G.

  2.转移600μL血清或血浆样品至含蛋白酶K的离心管中。振荡混匀5秒。

  3.加入0.9mL Buffer MLE至样品中,涡旋混匀15秒。室温或至55度放置10分钟,其间颠倒混匀次数。

  4.转移至磁力架上,静置3-5分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。

  5.加入600μL Bufer MWl,涡旋混匀15秒。

  6.转移至磁力架上,静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。

  7.加入600μL Bufer MW2,涡旋混匀15秒。

  8.转移至磁力架上,静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。

  9.重复第7-8步一次。

  10.短暂离心,收集管壁上的液滴。转移至磁力架上,小心吸弃所有溶液。

  11.空气干燥7-10分钟。

  12.加30-50μL预热至55℃的Bufer AE、Low TE或灭菌水等缓冲液,涡旋打散磁珠。静置3-5分钟,其间轻轻振荡1-2次加速DNA溶解。

  13.转移至磁力架上,静置3分钟。转移DNA溶液至新的1.5ml离心管中。

血浆样本

  4、DNA定量(Qubit)

  使用QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT及Qubit2.0进行DNA的定量,具体操作过程如下:

  1.配制Qbui HS定量工作液,具体的为199μL的Qubit dsDNA HS Bufer中加入1μL的Qubit dsDNA HS Reagent(染料);

  2.配制定量标准品:向定量管中加入19μL的Qbuit HS定量工作液,加入lμL的标准品1,命名为标准品1#;向定量管中加入19μL的Qubit HS定量工作液,加入1μL的标准品2,命名为标准品2#;

  3.配制待检测样本:向定量管中加入199μL的Qubit HS定量工作液,加入lμL的待检测样本;

  4.进行标准曲线校正:在主界面上,选择您想要运行标准品的分析类型(DNA,Double-Strand,HS),在样本槽放入标准品1#,进行读取,约3秒,在样本槽放入标准品2#,进行读取,约3秒,完成标准曲线校正。

  5.进行样本浓度检测:在样本槽放入待检测样本,进行读取,选择样本浓度单位ng/μL,并记录下样本浓度。

相关阅读
推荐阅读