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多套STR试剂盒在亲权鉴定中的应用评估

更新时间:2019-12-17 来源:法医学杂志 编辑:高洪梅

  常染色体STR基因座由于突变率低、稳定遗传及高度遗传多态性而广泛应用于法医学个体识别及亲权鉴定。当前常染色体亲权鉴定试剂盒均包含13个核心STR基因座, 但要求检测系统的累积非父排除率和个体识别率均应达到0.999 9以上。

  目前, 基点认知技术 (北京) 有限公司推出并广泛应用的常染色体STR试剂盒有GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A、25A和22NC, 共包括40个常染色体STR基因座 (D5S818、FGA、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E、D22S1045、D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500) .

  前期研究对GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A包含的19个常染色体STR基因座在山东汉族人群的遗传多态性进行了分析。Y-STR基因座具有独特的父系遗传方式。而对于X染色体, 父亲的X-STR可遗传给女儿, 母亲的X-STR可遗传给儿子及女儿。目前X-STR和Y-STR在法医学鉴定中应用广泛。

  在亲权鉴定中, 当有限的常染色体STR基因座检测出基因突变, 在了解案例的遗传背景前提下, 增加检测X-STR和Y-STR基因座对鉴定意见的出具可起到补充作用。在亲权鉴定案例中, 同一个样本用不同的试剂盒进行检测, 可出现个别STR基因座分型结果不一致, 存在等位基因的丢失, 这给亲权鉴定结果的分析带来风险。

  本研究对常染色体GoldeneyeDNA身份鉴定系统涵盖的、前期研究[3]尚未分析的其他21个常染色体STR基因座 (D22S1045、D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500) 在山东汉族人群中的遗传多态性进行分析, 同时对用GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A检测存在基因突变可能的案例, 增加检测常染色体STR基因座和X-STR (Y-STR) 进行分析。

  另外, 对用Goldeneye誖DNA身份鉴定系统20A、25A检测存在等位基因丢失的案例用AmpF STRIdentifilerPlus PCR扩增试剂盒及样本测序分析, 评估多套试剂盒在亲权鉴定中的应用。

  1、材料与方法

  1.1 材料

  日常鉴定案件中山东汉族人群273份无关个体的样本 (男性137份, 女性136份) 用于21个常染色体STR基因座的遗传学统计分析。用GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A检测, 存在基因突变可能的鉴定案例共6例, 其中三联体1例, 二联体5例。另外用GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A、25A检测存在等位基因丢失的案例有3例。样本采集前均告知当事人并征得同意。

  1.2 主要试剂与仪器

  GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A、25A、22NC、20Y、17X[基点认知技术 (北京) 有限公司], AmpF STRIdentifiler誖Plus PCR扩增试剂盒 (美国Thermo Fisher Scientific公司) , DNA标准品采用9947A和9948A.

  Hema 9600梯度基因扩增仪 (珠海黑马医学仪器有限公司) , 3500xL基因分析仪 (美国AB公司) .

  1.3 PCR扩增和STR基因座分型

  采用Chelex-100法提取血样DNA[9].对GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A、25A、22NC、20Y、17X和AmpF  STRIdentifilerPlus PCR扩增试剂盒分别进行复合PCR扩增, 操作按试剂盒说明书进行。PCR扩增产物用3500xL基因分析仪进行电泳测序, 以试剂盒中相应的等位基因分型标准物 (ladder) 为基因分型参照, 采用GeneMapper TM ID-X v1.3软件 (美国AB公司) 进行STR基因座分型。对经GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A、25A检测存在等位基因丢失的案例进行样本测序, 由基点认知技术 (北京) 有限公司提供技术支持。

  1.4 统计分析

  对273份无关个体21个常染色体STR基因座采用Cervus 3.0和Power Stats V12软件进行统计分析, 计算21个STR基因座的等位基因频率、匹配概率 (Pm) 、观察杂合度 (Ho) 、期望杂合度 (He) 、多态信息含量 (PIC) 、个体识别率 (DP) 、累积个体识别率 (CDP) 、非父排除率 (PE) 、累积非父排除率 (CPE) , 并进行Hardy-Weinberg平衡检验。

  本研究案例中父权指数 (PI) 和累积父权指数 (CPI) 的计算参照《亲权鉴定技术规范》 (SF/Z JD0105001-2016) , 基因突变率男性采用0.002 0, 女性采用0.000 5;D5S818、FGA、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E共19个基因座等位基因频率采用文献的数据, D22S1045基因座等位基因频率采用文献的数据, 其他20个基因座 (D2S441、D1S1656、D10S1248、D4S2366、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1132、D3S3045、D14S608、D17S1290、D3S1744、D18S535、D13S325、D7S1517、D10S1435、D11S2368、D19S253、D7S3048、D5S2500) 等位基因频率采用文献的数据。

  2、结果

  2.1 21个常染色体STR基因座的群体遗传学参数

  山东汉族人群273份无关个体21个常染色体STR基因座的等位基因频率见表1, 群体遗传学参数见表2.共得到225个等位基因, 通过Hardy-Weinberg平衡检验, 除D4S2366和D2S441基因座外, 其他19个STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡 (P>0.05) .21个常染色体STR基因座的CPE为0.999 999 997 9, CDP为0.999 999 999 9.

表1 山东汉族人群21个常染色体STR基因座的等位基因频率分布


表2 山东汉族人群21个常染色体STR基因座的群体遗传学参数

  注:1) Hardy-Weinberg平衡检验

  2.2 突变案例分析

  如表3所示, 突变案例1为三联体鉴定, 被检父与孩子存在2个基因座的基因突变, 采用GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A以及40个常染色体STR基因座检测, CPI值均>10 000.如作为父女二联体鉴定, GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A检测CPI值为5.218 4, 增加到40个STR基因座检测, CPI值为6.386 8×106, 孩子的X-STR分型均可在父母双方找到其生物学来源。

  突变案例2~5, 被检母或被检父与孩子存在一个基因座的基因突变, GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A检测的CPI值:0.000 1<CPI<10 000.增加到40个STR基因座检测, CPI值>10 000, 孩子的X-STR或Y-STR分型均可在其母亲或父亲找到其生物学来源。

  突变案例6, 采用GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A检测时, 孩子的D19S433和CSF1PO基因座的分型在被检父找不到生物学来源, CPI值为4.811 8×102, 而孩子的Y-STR分型与被检父相同, 增加到40个STR基因座检测, 共有6个基因座的分型在被检父找不到生物学来源, CPI值为5.169 0×10-10.孩子与父亲可能来自同一父系, 通过常染色体STR分型, 可排除被检父是孩子的生物学父亲。

表3 存在基因突变可能的案例

  注:“25A”指GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A;“20Y和17X”指GoldeneyeDNA身份鉴定系统20Y和17X;“22NC”指Golden-eyeDNA身份鉴定系统22NC;F指被检父;C指孩子;M指被检母

  2.3 等位基因丢失案例分析

  表4汇总了3例经GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A和25A分型并通过AmpFCSTR Identifiler Plus .PCR扩增试剂盒确认存在等位基因丢失的案例, 其中案例1~2经过基因测序分析, 案例3未进行测序分析。

  案例1, 在D18S51基因座, 被检母及孩子上游引物结合区5′端起第8个碱基由G突变为A, GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A和25A的相应引物无法结合, 导致等位基因19无法检出。案例2, 在D18S51基因座, 被检母及孩子下游引物3′端的四个碱基AAAC丢失, 而引物的3′端恰巧最后一个碱基与丢失后的相邻碱基C不匹配, Taq酶无法有效延伸, 导致等位基因12无法检出。

表4 GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A和25A检测存在等位基因丢失的案例

  注:F指被检父;C指孩子;M指被检母

  3、讨论

  亲权鉴定试剂盒均包含13个核心常染色体STR基因座, 同时需满足CDP和CPE均大于0.999 9.在不同地区、不同民族, 常染色体STR基因座的遗传多态性存在一定差异, 从而对鉴定案件数据的分析带来一定的影响。

  本研究统计了山东汉族人群21个常染色体STR基因座的遗传学数据, 其中, D7S3048多态性最高, D4S2366多态性最低;DP为0.889 5~0.967 8, PIC为0.690 3~0.857 2, PE为0.378 6~0.753 0, CPE为0.999 999 997 9, CDP为0.999 999 999 9, 说明该21个常染色体STR基因座在山东汉族人群中具有较高的遗传多态性。

  与前期研究统计的19个常染色体STR基因座联合共40个STR基因座, 基本满足日常检案鉴定的要求。通过Hardy-Weinberg平衡检验, D4S2366和D2S441不符合Hardy-Weinberg平衡 (P<0.05) , 可能与样本的采集及数量等因素有关。

  常染色体STR基因座平均突变率为0.012 0%~0.207 8%, 且大部分为一步突变, 二步、三步突变相对较少。鉴定案件中存在单个或两个基因座的突变对鉴定意见的出具影响很大。在父-母-子的三联体亲权鉴定中, 由于有亲生母亲的遗传背景, 存在突变情况下还比较容易出具鉴定意见。

  如突变案例1中, 父女存在两个基因座的基因突变:三联体鉴定时, 采用GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A检测的CPI值为3.751 9×104;而父女二联体鉴定时, CPI值为5.218 4, 当增加到40个STR基因座时, CPI值为6.386 8×106.在突变案例2~5的二联体鉴定案例中, 采用GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A检测的CPI值均达不到10 000, 而增加到40个STR基因座时才能出具支持的鉴定意见。

  因此, 出现基因突变时, 二联体亲权鉴定对检测的常染色体STR基因座数目要比三联体亲权鉴定要求多。

  目前, X和Y染色体STR基因座检测对常染色体检测试剂盒可起到补充作用。出现基因突变时, 在了解案例中相关人员的遗传背景前提下, 建议增加X-STR或Y-STR的检测, 从而保障鉴定意见的准确性, 但不能作为鉴定意见的唯一依据。

  突变案例1~5均增加了X或Y染色体STR基因座, 孩子的X-STR或Y-STR分型均可在其被检父或被检母找到生物学来源, 符合母系或父系遗传规律。而在突变案件6中, GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A中共有两个基因座存在可能的突变, CPI值为4.811 8×102, 当增加到40个STR基因座检测时, 孩子共有6个STR基因座的分型结果在被检父找不到其生物学来源, CPI值为5.169 0×10-10.虽然孩子的Y-STR基因座分型与被检父相同, 说明被检父与孩子可能来自同一父系, 但不是孩子的生物学父亲。

  在日常检案中, 个别STR基因座分型出现等位基因的丢失或分型结果不一致。本研究发现3例经GoldeneyeDNA身份鉴定系统20A和25A分析, 在一个基因座上被检母和孩子的基因分型存在很大差异, 可能存在等位基因的丢失, 用 扩增试剂盒检测进行了确认。其中2例经基因测序分析, 在相应的引物结合区被检母和孩子存在碱基的突变或丢失, 导致相应基因座等位基因丢失。如重新设计PCR引物, 避开有问题的碱基位置, 可有效解决等位基因丢失现象, 也可以先用不同公司生产的试剂盒进行检测来解决。目前, 这种等位基因的丢失现象已引起法医学鉴定领域的关注。

  综上所述, 本研究提供了山东汉族人群21个STR基因座的遗传学数据。对部分存在基因突变的二联体鉴定案例进行分析, 发现GoldeneyeDNA身份鉴定系统25A中的23个常染色体STR基因座并不能完全满足二联体鉴定要求, 存在基因突变时, 建议增加更多的常染色体STR基因座, 在了解遗传背景前提下, 同时增加X-STR或Y-STR检测系统作为补充。对存在等位基因丢失的案例, 改用不同公司的试剂盒或进行基因测序可以有效解决。

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